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En 1866, l'architecte Denis Bühler dessine le nouveau jardin botanique dans la partie orientale du parc du Thabor nouvellement acquise. Les plantes sont disposées en plates-bandes circulaires d'après la classification systématique des botanistes De Jussieu et De Candolle. Simon Sirodot alors professeur à la Faculté des Sciences de Rennes travaillera sur  l'organisation et la composition des grands groupes végétaux. Cette organisation présente le monde végétal en quatre classes avec dans l'ordre : les acotylédones (Fougères, Prêles) les monocotylédones, les dicotylédones et les gymnospermes (Conifères).
 
Au total, 3122 taxons sont répertoriés et présentés dans 11 plates-bandes bordées de buis. La visite s'effectue sous la forme d'une spirale en débutant par les Fougères pour terminer au bassin central. Pour l'étiquetage, des couleurs différentes signalent les diverses utilisations et propriétés des plantes : rouges pour les médicinales, blanches pour les comestibles, noires pour les toxiques, jaunes pour les industrielles (huile, teinture, textile, etc.) et vertes pour les plantes sans propriétés. Une étiquette bleue débute et précise chaque nouvelle famille. Le nom scientifique est indiqué avec le genre et l'espèce ainsi que l'origine géographique ou le nom français.

Tous les continents sont représentés dans des zones géographiques aux climats variés (alpines, méditerranéennes, atlantiques, continentales, asiatiques, américaines, australes). La flore spontanée est aussi bien présente avec des plantes de différents milieux écologiques (landes, marais, tourbières, littoraux, boisements, prairies, friches, cultures, calcicoles, aquatiques). La manière douce s'impose pour la culture de toutes ces plantes. Un certain équilibre semble s'installer sans l'utilisation de pesticides. Les produits phytosanitaires chimiques ont été abandonnés au profit des auxiliaires naturels. Il n'y a pas d'introduction de prédateurs, seule la faune originelle est préservée avec l'installation de nichoirs et abris pour les insectes et les oiseaux. Le sol est protégé par divers paillages (broyage, feuilles mortes, tonte de pelouses).

Le jardin botanique publie un catalogue de graines qu'il échange avec d'autres institutions, villes et universités à travers le monde. Environ 120 correspondants proposent également leurs catalogues et des commandes de graines sont réalisées. Nos récoltes se font au Thabor sur la plupart des familles mais aussi dans les milieux naturels du département d'Ille et Vilaine. Suivant les années, autour de 1800 échantillons sont expédiés et 400 arrivent pour compléter nos collections.

Le secteur botanique participe aussi au développement de la flore spontanée au sein de la Direction des Jardins. Des inventaires sont réalisés sur les espaces verts de la ville et sur le territoire rennais. Des études sont menées pour contribuer à l'enrichissement de la flore locale avec des introductions de végétaux adaptés aux multiples milieux créés ou existants. Parmi les exemples de réalisations, on peut citer la plantation de bords de mares, le fleurissement champêtre sur les lisières et les anciennes haies bocagères, le semis de talus et de prairies naturelles.

En ces temps nouveaux où le retour de la nature en ville et la biodiversité sont des sujets primordiaux, ce jardin botanique historique reste très important pour la connaissance du monde des plantes. Ne disait-on pas à son origine, que c'était un musée de la flore.